基因編輯（gene-editing）的基本原理其實(shí)就類似 word 程序中的查找、替換或者刪減過(guò)程，即人為地修飾宿主細(xì)胞 DNA 序列后，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定的目的基因片段的“編輯”——敲除/敲入，從而達(dá)到改變宿主細(xì)胞的基因型的目的。隨著科學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，基因編輯技術(shù)已經(jīng)日益成熟，想要實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的編輯變得不再那么困難，特別是第三代技術(shù) CRISPR/Cas9 的出現(xiàn)，目前被認(rèn)為是最簡(jiǎn)單高效的基因編輯手段。

下面小編就帶著大家看看基因編輯是如何一步步壯大的。

第一代技術(shù)： ZFN（鋅指核酸酶） 
出現(xiàn)時(shí)間：1996 年 
組成單元：識(shí)別特定的 DNA 序列的 ZFN ＋ 核酸內(nèi)切酶 FOKI
發(fā)現(xiàn)：鋅指結(jié)構(gòu)域 ZFN（Zinc Finger Nucleases , ZFN）是真核生物中最為普遍的 DNA 結(jié)合模塊

作用原理： 
1. 一對(duì)人工設(shè)計(jì)的，識(shí)別特異 DNA 序列的鋅指核酸酶ZFN與目標(biāo)DNA序列結(jié)合；
2. FokI 核酸內(nèi)切酶將形成二聚體，從而割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂 ( double strand break, DSB)，DNA 損傷后修復(fù)會(huì)造成基因敲除或敲入等。
通過(guò)加工改造 ZFN 的 DNA 結(jié)合域，便可靶向不同的 DNA 序列，進(jìn)行特異性切割。

應(yīng)用：

1. 構(gòu)建基因編輯的模式動(dòng)物；
2. 遺傳育種；
3. 基因治療。

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)計(jì)比較簡(jiǎn)單，效率較高。
缺點(diǎn)：1. 勞動(dòng)量大，周期長(zhǎng)； 2. 成功率低易脫靶； 3. 細(xì)胞毒性大。

重大突破：Sangamo Biosciences公司基于ZFNs技術(shù)治療艾滋病CCR5的方法已經(jīng)進(jìn)入臨床II期試驗(yàn)，這是史上第一次應(yīng)用基因編輯技術(shù)來(lái)治療人類疾病。

第二代技術(shù)： TALEN（轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶） 
出現(xiàn)時(shí)間：2011年
組成單元：識(shí)別特異DNA序列的蛋白分子TALE ＋ 核酸內(nèi)切酶FOKI
發(fā)現(xiàn)：源于黃單胞菌屬（Xanthomonas）植物病原菌，它通過(guò) III 型分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白（TALEN（Transcription Activator-like effector, TAL effector））輸入植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，類似于模擬真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行重編程。

作用原理：

TALEN的結(jié)構(gòu)及作用原理圖（引自文獻(xiàn)1）

1. 人工設(shè)計(jì)識(shí)別特異DNA序列的TALEN與目標(biāo)DNA序列結(jié)合；
2. FokI核酸內(nèi)切酶切割DNA雙鏈，雙鏈斷裂DNA后，損傷后修復(fù)會(huì)造成基因敲除或敲入等。
TALEN包括中間串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域，核定位信號(hào)以及酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，且高度保守。TAL效應(yīng)因子對(duì)靶點(diǎn)的特異性是由重復(fù)模塊數(shù)目和排列順序決定的。

應(yīng)用：

1. 構(gòu)建基因編輯的模式動(dòng)物；
2. 遺傳育種；
3. 基因治療。

優(yōu)點(diǎn)：平臺(tái)比較成熟。
缺點(diǎn)：1. 依賴上下游序列；2.脫靶率較高；3. 具有細(xì)胞毒性。

重大突破：2012年的《科學(xué)》（Science）則將TALEN技術(shù)列入了年度十大科技突破；

Cellectis公司用TALEN改造的基于異源基因的CAR-T——UCART19成功緩解了Layla的不治之癥–急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）。

第三代技術(shù)：CRISPR/Cas9（成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列）
出現(xiàn)時(shí)間：2013年
組成單元：成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR + 核酸內(nèi)切酶Cas9
發(fā)現(xiàn)過(guò)程：CRISPR系統(tǒng)是古細(xì)菌和細(xì)菌的一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御機(jī)制，早在1987年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌里有串聯(lián)間隔重復(fù)序列，直到2002年被命名為CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats）。2012年CRISPR/Cas9的詳細(xì)作用機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，并預(yù)測(cè)可作為基因編輯技術(shù)。

作用原理：人工設(shè)計(jì)的gRNA（ guide RNA）來(lái)識(shí)別目的基因組序列，并引導(dǎo)Cas9蛋白酶進(jìn)行有效切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂，損傷后修復(fù)會(huì)造成基因敲除或敲入等。

應(yīng)用：

1. 構(gòu)建基因編輯的模式動(dòng)物；
2. 遺傳育種；
3. 基因治療。

優(yōu)點(diǎn)：較前兩代技術(shù)更加高效、快捷、準(zhǔn)確、廉價(jià)。
缺點(diǎn)：1. 有局限性，靶序列前無(wú)PAM序列不能切割；2. 仍存在一定的脫靶效應(yīng)。 

重大突破：已成立多家CRISPR相關(guān)公司，致力于用來(lái)治療基因遺傳病，已在很多疾病取得較好臨床前效果。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成及作用原理圖（引自文獻(xiàn)2）

共同點(diǎn)：切割DNA后造成的損傷及修復(fù)過(guò)程
DNA雙鏈斷裂后，主要通過(guò)易錯(cuò)性的非同源末端連接（Non -homologous end joining, NHEJ）以及高保真性的同源重組（homologous recombination HR）進(jìn)行修復(fù)，最終會(huì)造成基因敲入（knock in）、敲除（knock out）、缺失（deletion）及基因修飾（gene modification）這幾種類型。

DNA損傷后介導(dǎo)的修復(fù)途徑（引自文獻(xiàn)3）

基因編輯看似很高大上，又很深?yuàn)W的知識(shí)，其實(shí)大家用心地經(jīng)歷本次的學(xué)習(xí)后，相當(dāng)于已經(jīng)邁向了很大一步了?？偨Y(jié)一下，基因編輯技術(shù)至此已經(jīng)發(fā)展到第三代，一代比一代高效快捷，陸續(xù)也一直有新技術(shù)出現(xiàn)，相信編輯基因組DNA會(huì)更加簡(jiǎn)單。  

參考文獻(xiàn)
1. Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7): 397-405.
2. DiCarlo, Julie E. Norville1, George M. Church. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 339(6121): 823-826.
3. Tomoji Mashimo. (2014) Gene targeting technologies in rats: Zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Development Growth Differentiation, 56(1): 46–52