在 2021 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——第二十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議上，來自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的施毅教授為我們講解了真菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷的相關(guān)問題。
與細(xì)菌感染一樣，真菌感染也是一個(gè)永恒的三角（宿主、環(huán)境、真菌）。但不同于細(xì)菌感染的診斷，真菌感染診斷分 3 級(jí)原則：擬診、臨床診斷及確診。所以要達(dá)到確診，真菌的病原學(xué)診斷是金標(biāo)準(zhǔn)。(圖 1)真菌微生物診斷方法的變遷：包括常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查（涂片鏡檢和培養(yǎng)）、生物標(biāo)志物檢測(cè)（血清 GM、G 試驗(yàn)）；和分子生物學(xué)檢查（PCR、mNGS）（圖 2）。國內(nèi)目前的真菌實(shí)驗(yàn)室檢查存在的問題：一些非常有用的檢查沒有開展：比如，分泌物涂片、鏡檢與培養(yǎng)做得不好；分泌物或血清抗原檢測(cè)開展不足；血清抗體檢測(cè)很少開展；分子生物學(xué)檢測(cè)（PCR、mNGS）存在過度檢查。對(duì)非?？煽康慕Y(jié)果解讀有誤：微生物培養(yǎng)陽性就是感染？血清 GM 試驗(yàn)陰性就可以排除真菌感染？血清抗體檢測(cè)真菌感染的價(jià)值如何？mNGS 序列數(shù)很高就是感染？等等。真菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷到底該信哪個(gè) G？血清 GM 試驗(yàn)：血清 GM 試驗(yàn)陽性就可以診斷、陰性就可以排除侵襲性真菌??？（Galactomannan，GM）試驗(yàn)即半乳甘露聚糖試驗(yàn)，半乳甘露聚糖是曲霉生長時(shí)分泌的一種多糖抗原標(biāo)記物，是早期感染的指標(biāo)。GM 試驗(yàn)是嚴(yán)重免疫抑制 / 粒細(xì)胞缺乏患者診斷侵襲性曲霉?。↖A）的有效工具。關(guān)于 GM 試驗(yàn)判定閾值的更新： 早期血清 GM 試驗(yàn)診斷曲霉病的推薦折點(diǎn)為單次 0.5，2018 年之后，建議如果以 0.5 為折點(diǎn)應(yīng)該連續(xù)兩次試驗(yàn)為陽性，單次檢測(cè)時(shí)折點(diǎn)應(yīng)為 0.7 或 1.0。 2019 年 EORTC/MSG 第三版侵襲性真菌?。↖FD）指南再次做出修訂：推薦檢測(cè)血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、血漿和腦脊液中 GM 診斷 IA；①單份血清或血漿：閾值 ＞ 1.0；②單份 BALF ＞ 1.0；③單份腦脊液 ＞ 1.0；④同時(shí)檢測(cè)血清和 BALF 時(shí)：血清閾值 ＞ 0.7，BALF 閾值 ＞ 0.8（圖 3）。同時(shí)強(qiáng)調(diào)：不同臨床標(biāo)本應(yīng)采用不同閾值，但不同疾病類型的閾值應(yīng)該相同（如急性、慢性、變應(yīng)性），成人和兒童適用相同的 GM 閾值。 假陽性見于：① 抗菌藥物：阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、碳青霉烯類、亞胺培南/西司他??；② 其他侵襲性真菌?。ㄇ嗝?、鐮孢霉、組織胞漿菌、皮炎芽生菌等）；③ 新生兒雙歧桿菌定植；④ 多發(fā)性骨髓瘤。GM 試驗(yàn)在臨床真菌感染診斷中的價(jià)值： GM 在侵襲性曲霉?。↖A）中有重要的臨床診斷意義，尤其在粒缺患者中，血清 GM 意義重大；但是如果預(yù)防性或前期應(yīng)用抗曲霉治療會(huì)明顯降低血清 GM 的診斷價(jià)值。 非粒缺患者，血清 GM 敏感性明顯下降，陰性不能除外感染；這個(gè)時(shí)候，對(duì)于非粒缺或預(yù)防性應(yīng)用抗曲霉治療患者推薦使用 BALF GM（圖 4），注意不同標(biāo)本檢測(cè) GM 的閾值不同。同時(shí) GM 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可以反映治療的療效，但要注意 GM 檢測(cè)的影響因素。 血清 G 試驗(yàn)：G 試驗(yàn)陽性就可以診斷、陰性可以排除侵襲性真菌??？（1-3）-β-D 葡聚糖檢測(cè)（G 試驗(yàn)）是以真菌細(xì)胞壁特有的（1-3）-β-D 葡聚糖為標(biāo)記物的檢測(cè)方法。因此并不是一種真菌特有的，是一個(gè)泛真菌的檢測(cè)手段。 G 試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)的真菌類型包括念珠菌、曲霉、耶氏肺孢子菌、毛孢子菌、鏡刀菌、支頂孢霉等； 而 G 試驗(yàn)不能檢測(cè)的真菌類型包括隱球菌、毛霉（根霉、毛霉、根毛霉、梨頭霉、小克銀漢霉等）。 目前國內(nèi)外指南主要推薦 G 試驗(yàn)為侵襲性念珠菌病的判定指標(biāo)。 目前，國內(nèi)外指南推薦 G 試驗(yàn)在診斷侵襲性念珠菌病時(shí)采用單一閾值：＞ 80 pg/mL，且推薦連續(xù)做 2 次檢測(cè)，目前很多臨床醫(yī)生只做一次（圖 5）。另外強(qiáng)調(diào) G 試驗(yàn)對(duì)于檢測(cè)耶氏肺孢子菌（PJP）也有很大價(jià)值，在排除其他侵襲性真菌病的情況下，2 次或 2 次以上的血清 BDG ≥ 80 pg/mL，可以考慮 PJP，但陰性排除 PJP 的價(jià)值高于陽性診斷 PJP 的價(jià)值（圖 6）。圖 6（注：IA 侵襲性曲霉病、IC 侵襲性念珠菌病、IFD 侵襲性真菌病、PJP 耶氏肺孢子菌）假陽性見于：① 纖維素膜（含葡聚糖成分）進(jìn)行血液透析；② 血液制品（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）；③ 抗菌藥物（磺胺類藥物、阿莫西林/克拉維酸、多粘菌素、厄他培南、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢吡肟）；④ 革蘭陰性菌菌血癥；⑤ 黏膜炎或胃腸黏膜受損；⑥ 手術(shù)時(shí)應(yīng)用的紗布或海綿（含葡聚糖成分）；⑦ 抗癌藥物 (含葡聚糖如香菇多糖) 。
假陰性見于：① 隱球菌和毛霉感染；② 抗真菌藥使用。G 試驗(yàn)在臨床真菌感染診斷中的價(jià)值： G 試驗(yàn)在侵襲性真菌?。↖FD）中有重要的臨床診斷意義，尤其在除隱球菌及毛霉外的多種真菌感染，為國內(nèi)外指南推薦；且 G 試驗(yàn)是早期檢測(cè)方法，先于臨床癥狀 4 天，早于發(fā)熱 5 天，早于呼吸道癥狀 11 天，血培養(yǎng)報(bào)陽前 10 天內(nèi)呈陽性； 但目前 G 試驗(yàn)只認(rèn)可血清 G 試驗(yàn)，可在 1.5 ~ 2 小時(shí)內(nèi)快速出結(jié)果，需注意國內(nèi)試劑盒眾多，閾值不一，所以解讀結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎；對(duì)于念珠菌血癥，G 試驗(yàn)是首選檢查，對(duì)于肺孢子菌感染也有很大價(jià)值，但干擾因素較多；G 試驗(yàn)也對(duì)是否停止侵襲性念珠菌感染高?；颊叩慕?jīng)驗(yàn)性抗真菌治療有重要的參考價(jià)值。
血清曲霉特異性 IgG 抗體：陽性就可以診斷、陰性就可以排除侵襲性曲霉??？慢性肺曲霉病（CPA）的種類很多，因此相比于侵襲性肺曲霉病，慢性肺曲霉病發(fā)病率更高。對(duì)于侵襲性肺曲霉病，由于起病迅速且患者免疫力低，不足以產(chǎn)生足夠的免疫球蛋白 IgG。但是在 CPA 中血清曲霉特異性 IgG 抗體有最高的檢測(cè)陽性率（推薦等級(jí) A，圖 7-8）。煙曲霉特異性 IgE 抗體水平升高對(duì)變應(yīng)性支氣管肺曲霉?。ˋBPA）診斷更有特異性（圖 9）。念珠菌抗體的檢測(cè)也逐漸發(fā)展起來，以下四組抗體的檢測(cè)如果可以同時(shí)進(jìn)行，可以作為早期侵襲性念珠菌?。↖C）的快速診斷依據(jù)，可以區(qū)分念珠菌的定植與感染，且與其他真菌無交叉反應(yīng)，聯(lián)合檢測(cè)可提高陽性率（圖 10）。曲霉 IgG 抗體檢測(cè)干擾因素：① 組織胞漿菌、球孢子菌感染交叉造成假陽性；② 血液制品，免疫球蛋白治療造成假陽性，但是一般陽性數(shù)值會(huì)很快下降；③ 抗真菌藥對(duì)抗體影響：小于抗原，但長期抗真菌治療還是可對(duì)抗體濃度造成影響。念珠菌抗原、抗體檢測(cè)干擾因素：① 念珠菌 Mn 試驗(yàn)假陽性的影響因素：抗病毒藥物阿昔洛韋、伐昔洛韋；② 念珠菌 IgG 抗體假陽性的影響因素：絲孢子菌、隱球菌交叉反應(yīng)造成假陽性，血液制品，免疫球蛋白治療。血清真菌特異性 IgG 抗體在真菌感染診斷中的價(jià)值： 血清曲霉特異性 IgG 抗體在曲霉球、CPA（CNPA、CCPA、CFPA）診斷中是最重要的微生物學(xué)證據(jù)；血清曲霉特異性 IgG 抗體可以用于監(jiān)測(cè)抗曲霉治療的療效，有助于區(qū)別定植與感染；且曲霉抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)，能覆蓋更多的曲霉感染人群，對(duì)侵襲性肺曲霉?。↖PA）也有一定的輔助診斷價(jià)值；曲霉特異性 IgE 是 ABPA 診斷的必備條件；血清念珠菌抗體檢測(cè)可早期快速診斷 IC，聯(lián)合檢測(cè)可以提高陽性率。
mNGS 檢測(cè)：陽性就可以診斷、陰性就可以排除侵襲性真菌?。?/strong>mNGS 價(jià)格昂貴，但國內(nèi)應(yīng)用較多，這可能與國內(nèi)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查較少（只有發(fā)達(dá)國家的三分之一），很多病原體難以檢測(cè)有關(guān)。但對(duì)于真菌感染的分子生物學(xué)檢測(cè)，目前國內(nèi)外只認(rèn)可 PCR；不論曲霉還是念珠菌，如果組織標(biāo)本的 PCR 陽性均屬于確診依據(jù)；而血清、BALF 的 PCR 檢測(cè)陽性只能作為曲霉的臨床診斷依據(jù)（圖 11）。mNGS 用于真菌檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)： 優(yōu)勢(shì)：不需要培養(yǎng)，節(jié)省時(shí)間；相較傳統(tǒng)方法（G/GM 試驗(yàn)）可以精確區(qū)分物種，甚至亞型，特異性高；在某些類型真菌的檢測(cè)敏感性高于傳統(tǒng)方法，比如曲霉；無需假設(shè)，可覆蓋罕見真菌和其他類型病原體；可檢測(cè)真菌的耐藥基因。
劣勢(shì)：對(duì)采樣要求較高，需要有效采集真菌感染的病灶部位；但真菌細(xì)胞壁厚（如曲霉），或有堅(jiān)固莢膜（如隱球菌），破壁困難，核酸不易釋放，可造成假陰性；在濕實(shí)驗(yàn)流程（比如建庫）容易引入環(huán)境真菌或試劑中真菌核酸（如灰綠曲霉）的污染，造成假陽性；還有就是真菌基因組數(shù)據(jù)庫不全，很多真菌缺乏全基因組數(shù)據(jù)（識(shí)別不出），且在公開的數(shù)據(jù)庫中真菌序列經(jīng)常存在人源序列的污染（識(shí)別錯(cuò)誤）。所以我們?cè)?mNGS 檢測(cè)真菌時(shí)要注意：最佳檢測(cè)標(biāo)本是 BALF；在技術(shù)上改進(jìn)破壁技術(shù)；合理的去除人源背景，提高病原體的檢出率；完善真菌基因數(shù)據(jù)庫。mNGS 的真菌檢測(cè)結(jié)果的解讀： 高等級(jí)的致病性真菌：如曲霉、肺孢子菌、馬爾尼菲籃狀菌、新生隱球菌，在大部分樣本中都可能是病原體。中等級(jí)的條件致病菌：如念珠菌屬，在外周血、腦脊液、穿刺液等無菌體液樣本中可能是病原體，但在痰液、BALF、尿液中可能是共生菌，需結(jié)合臨床特征慎重判斷致病可能性。低等級(jí)的條件致病菌：如念珠菌，在外周血、痰液、BALF、尿液等大部分樣本中可能是共生菌，只在少數(shù)情況下如侵入操作后的腦脊液 / 外周血樣本、感染性心內(nèi)膜炎的贅生物中可能致病。疑似背景微生物引起感染：在某些感染樣本中能與低等級(jí)的條件致病菌相互轉(zhuǎn)化。2. 結(jié)合臨床判讀結(jié)果： 在陽性結(jié)果的判讀中：若 mNGS 結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢查，推薦根據(jù) mNGS 結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。若患者 mNGS 結(jié)果陽性且符合臨床表現(xiàn)，但缺乏除 mNGS 結(jié)果外的其他實(shí)驗(yàn)室支持證據(jù)，應(yīng)進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，并進(jìn)一步完善傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查加以驗(yàn)證。 若患者 mNGS 結(jié)果陽性，但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室檢查結(jié)果不支持該結(jié)果，則不能僅根據(jù) mNGS 結(jié)果進(jìn)行診斷，而應(yīng)以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為首要臨床參考依據(jù)。 在陰性結(jié)果的判讀中：真陰性，排除感染；假陰性，根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果高度提示感染可能，建議再次重復(fù) mNGS 檢測(cè)。目前分子生物學(xué)（PCR、mNGS）已經(jīng)在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，其中 PCR 在曲霉和念珠菌感染病理標(biāo)本中有確診價(jià)值；mNGS 在我國剛剛普及，正在累積檢驗(yàn)，可以作為輔助診斷的指標(biāo)，但尚不能作為病原學(xué)的確診依據(jù)；mNGS 給臨床提供了一種具有很高敏感性和特異性的病原微生物檢測(cè)方法，具有劃時(shí)代的意義；mNGS 不應(yīng)該用于普通感染患者，而是疑難、危重、特殊感染的患者，目前尚不倡導(dǎo)用于療效隨訪和耐藥性檢測(cè)；重點(diǎn)關(guān)注 mNGS 報(bào)告的正確解讀，要做到小心謹(jǐn)慎，結(jié)合臨床，綜合評(píng)估。 BALF-GM 是侵襲性肺曲霉病最好的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)； 血清 G 試驗(yàn)主要針對(duì)念珠菌血癥； 血清曲霉 IgG 抗體，是慢性曲霉病的首選檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)； mNGS 主要推薦應(yīng)用于疑難危重、特殊感染的患者。 無論何種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，都需要結(jié)合臨床評(píng)估才有意義。 鳴謝：南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院 施毅教授
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